Sólo pruebas sensibles y específicas pueden detectar de manera fiable las fusiones génicas NTRK y ROS1 1-3

  • Existen múltiples pruebas moleculares disponibles para detectar fusiones de genes, pero algunas son más específicas que otras1,2,4-11
  • La secuenciación de última generación (NGS) tiene alta sensibilidad, exactitud y rendimiento necesarios para evaluar todas las fusiones de genes9-16

Tecnologías disponibles para la detección de fusiones génicas

NGS

Secuenciación de última generación (NGS)

Habilidad para detectar diferentes fusiones

Detecta fusiones en los tres genes NTRK y en el gen ROS14,9

NGS es una manera sensible y específica de detectar todas la posibles variantes de las fusiones NTRK, así como también,de identificar otros biomarcadores en una única prueba molecular integral. ARN-NGS puede detectar tipos de fusión ROS1 y la posición de los reordenamientos genómicos.4,5,9

Fiabilidad

La fiabilidad varía dependiendo del ensayo utilizado17

Existen diferentes paneles NGS que tienen como blanco diferentes regiones de la secuencia, y la profundidad de cobertura varía entre ensayos. Los requerimientos de contenido tumoral pueden también variar entre ensayos.17

Ventajas

Pueden detectar nuevos tipos de fusión y evaluar múltiples blancos accionables18

Dependiendo del ensayo utilizado, NGS puede evaluar múltiples y nuevos tipos de fusión, preservando el tejido limitado. La secuenciación de ARN se focaliza en las secuencias codificantes y no en los intrones, y es apropiada para la detección de fusiones génicas.5,18

Desventajas

Puede no identificar todas las fusiones NTRK y ROS118

La técnica ADN-NGS está limitada por el tamaño del intrón. ARN-NGS es apropiada para la detección de fusiones génicas pero podría estar limitada por la calidad del ARN.5,18

Muestra

Cuando se pide una prueba NGS, se debe estar seguro que incluya el análisis de fusión para los tres genes NTRK; NTRK1, NTRK2, and NTRK319

Los resultados de las pruebas ayudarán a identificar tumores sólidos positivos para fusiones NTRK

El contenido específico del reporte de cada paciente va a depender del método del ensayo utilizado y del laboratorio.


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IHC

Inmunohistoquímica (IHC)

Habilidad para detectar diferentes fusiones

Puede detectar proteínas codificadas por los genes NTRK y ROS1 pero se requieren pruebas adicionales para confirmar fusiones génicas2,5,9,13

Para ser utilizada como herramienta de screening - se requieren otras metodologías para confirmar fusiones génicas. Los anticuerpos Pan-TRK pueden detectar la presencia de proteínas codificadas por cualquiera de los tres genes NTRK pero no pueden diferenciar entre una proteína fusión o una proteína wild-type.2,5,13

Fiabilidad

Detecta proteínas TRK y ROS1 con alta especificidad y sensibilidad2,5

Está reportado que: los anticuerpos Pan-TRK presentan 95-100% de sensibilidad y hasta un 100% de especificidad para las proteínas TRK; y los anticuerpos ROS1 presentan 100% de sensibilidad y una especificidad que varía entre 70% hasta 100%, dependiendo del umbral utilizado para definir la positividad.2,9,10  

Ventajas

Bajo costo y fácilmente disponible2,9,18

Los anticuerpos Pan-TRK detectan proteínas TRK A, B y C en un plazo de 1-2 días.18

Desventajas

No puede diferenciar de manera fiable entre la expresión de una proteína normal y aquella resultante de un reordenamiento genómico9,18

La técnica IHC puede detectar las proteínas TRK y ROS1 fusión como wild type, conduciendo a posibles falsos positivos. Existe, también, un riesgo de posibles falsos negativos para las fusiones que involucran a TRKC. Por lo tanto, son requeridas pruebas adicionales para confirmar la presencia de reordenamientos génicos.9,18

Muestra

Tinción de un ensayo Pan-TRK de una muestra de cancer colorrectal que presenta fusión EML4-NTRK1(izquierda) y de una muestra de carcinoma secretor que presenta fusión ETV6-NTRK3 (derecha). El estado de fusión está basado en pruebas NGS.20 


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FISH

Hibridización por inmunofluorescencia in situ (FISH)

Habilidad para detectar diferentes fusiones

Puede detectar ambas fusiones NTRK y ROS1, dependiendo de las sondas utilizadas18,19

Diferentes sondas son requeridas para cada gen NTRK.21 Para la detección de fusiones ROS1 se utilizan sondas “break-apart” de dos colores, las cuales marcan la parte 3’ (centromérica) del punto de quiebre de la fusión con un fluorocromo de un color y la parte 5’ (telomérica) con otro. Los reordenamientos son determinados mediante el análisis del patrón de colores de los fluorocromos.9,21 

Fiabilidad

Pueden ocurrir falsos negativos o falsos positivos9,18

La fiabilidad depende de la sonda utilizada. Existe el riesgo de resultados falsos positivos debido a las traslocaciones cromosómicas complejas y a la detección de proteínas de fusión no-funcionales.9,18 Es posible que algunas variantes o reordenamientos complejos no se detecten.1,2,9,18 En algunos casos, los resultados falsos negativos pueden ser superiores al 30%.18

Ventajas

Fácilmente disponible, la técnica de FISH “break-apart” es el estándar de oro para la detección de las fusiones ROS110,21

Permite la visualización del objetivo dentro de la célula y posibilita que diversos blancos sean detectados en una misma muestra utilizando múltiples fluoróforos.10,18 El uso de sondas separables permite la detección de tipos de fusiones desconocidos.18

Desventajas

La técnica de FISH convencional puede requerir de múltiples pruebas para detectar fusiones NTRK

La secuencia blanco debe ser conocida para poder utilizar la técnica de FISH convencional, y se requieren tres pruebas separadas para NTRK1, NTRK2 y NTRK3.18 Depending on the type of translocation there is also a risk of false positive or false negative results.9,18

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PCR

Polymerase chain reaction (PCR)

Habilidad para detectar diferentes fusiones

Requiere múltiples sets de primers para detectar las fusiones génicas18,22

La localización de los reordenamientos no es conocida al momento de la realización de la prueba, entonces, son requeridos múltiples sets de primers, uno para cada variante de fusión.18,21,22

Fiabilidad

Confiable para los tipos de fusiones conocidas, requiere confirmación por FISH cuando se testea para fusiones ROS110

Cada variante requiere un set específico de primers. Entonces, la técnica de PCR puede perderse variantes desconocidas o variantes no testeadas.7,9,21,22 La expresión de ROS1 es detectable en tejido normal de pulmón, la prueba por PCR no es lo suficientemente específica para detectar, en pacientes con cáncer de pulmón, tumores ROS1+ sin confirmación por FISH.11,22

Ventajas

Costo bajo por ensayo, con alta sensibilidad y especificidad18

Desventajas

Solo puede detectar secuencias blanco conocidas18

La secuencia blanco debe ser conocida y no es posible detectar fácilmente nuevas variantes de fusión. Un ensayo multiplex integral de RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) podría ser un desafío debido al número potencialmente alto de posibles variantes 5’ de fusión.10,18

No filter results

Una prueba molecular apropiada puede ayudar a descubrir fusiones génicas.4,5,18 Tu patólogo puede ayudar a decidir cuál es la mejor opción de prueba para cada paciente.

Notas a pie de página:

FISH, hibridización de fluorescencia in situ; IHC, inmunohistoquímica; NGS, secuenciación de nueva generación; CPCNP, cáncer de pulmón de células no pequeñas; RT-PCR, reacción de cadena de polimerasa de transcripción reversa.

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